摘 要：筛选高效解硅细菌并对其发酵条件进行优化，是铁尾矿的利用和微生物肥料开发及应用的基础。本试验从土壤样品中分离筛选得到一株高效解硅菌株HDB02，结合菌落形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，初步鉴定为土壤杆菌(Agrobacterium sp.)；通过单因素试验与响应面试验对HDB02的发酵条件进行优化，结果表明HDB02的最佳发酵培养条件为: 蔗糖11.3g/L，硝酸钠1.03 g/L，初始pH 7.62，培养温度32 ℃，培养周期5 d。这一结果为铁尾矿的利用及微生物肥料的研制提供了参考。
关键词：解硅细菌；筛选；鉴定；土壤杆菌；发酵条件优化
Screening, identification and optimization of fermentation conditions of an efficient desilicification strain of bacteria
Shen Yue1 Yang Junfeng1 Zhang Yaodan1 Zhang Hui1*
(1. College of Pharmaceutical and Bioengineering, Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, China)
Abstract: Screening high-efficiency desilicification bacteria and optimizing their fermentation conditions are the basis for the utilization of iron tailings and the development and application of microbial fertilizers. In this experiment, an efficient desilicification strain HDB02 was isolated and screened from soil samples, and was initially identified as Agrobacterium sp. by combining morphological characteristics, physiological and biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis. The results showed that the optimal fermentation conditions for HDB02 were: sucrose 11.3 g/L, sodium nitrate 1.03 g/L, initial pH 7.62, incubation temperature 32 ℃, and incubation period 5 d. This result provides a reference for the utilization of iron tailings and the development of microbial fertilizer.
Keywords: desilicification bacteria; screening; identification; soil bacillus; optimization of fermentation conditions
硅是植物体生长发育必需的17种元素之一[1]，能提高作物光合作用效率、根系活性、抗旱能力、抗病能力和产量等[2-6]。虽然硅元素在地壳中含量排在第二位[7]，但植物体生长期间对硅的吸收量主要取决于土壤的有效硅含量[8]。据调查表明，我国40%以上面积的耕地土壤缺乏有效硅[9]。与此同时，我国每年排出十几亿吨铁尾矿，占用大量国土资源，还会造成空气、水污染等环境问题，铁尾矿中含有大量硅酸盐[10]，但不能被植物直接利用，若分离筛选出高效解硅菌株作用于铁尾矿，研制微生物肥料，既能改善尾矿堆积污染问题，又能提高土壤有效硅含量。目前应用于农业的硅酸盐细菌研究主要集中于解钾、解磷细菌的分离筛选，解硅细菌的研究较少，其中南京农业大学的曹建芳[11]从水稻土中分离筛选出一株高效解硅菌株为根瘤菌属（Rhizobium sp.），盆栽试验结果表明，接入该菌株菌悬液试验组植株生物量以及土壤硅含量均显著高于对照组。综上所述，分离筛选高效解硅菌株研制微生物肥料仍是目前研究的重点之一。本试验从土壤中分离筛选高效解硅菌株，通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行菌种鉴定，并通过单因素试验和响应面试验对其发酵条件优化，为铁尾矿的利用和微生物肥料的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
铁尾矿样品：取自葫芦岛市建昌县贺杖子乡碾房村，铁尾矿石在1mol／L盐酸中浸泡24h后，用去离子水清洗至无氯离子后烘干，过100目筛备用。
土壤样品：辽宁省葫芦岛市建昌县石门沟耕地土样；葫芦岛市建昌县王姓沟耕地土样；葫芦岛市建昌县碾房耕地土样；葫芦岛市建昌县老聂家耕地土样；葫芦岛市建昌县铁矿山土样；沈阳化工大学校医院花坛土样；沈阳化工大学地下通道校内出口土样；沈阳化工大学瑞师楼路灯土样；沈阳化工大学祥麟楼假山土样；沈阳化工大学应星楼花坛土样。采用三点取样法，在每个采样点上垂直向下挖出一个剖面，取距离地面10~20cm处的土壤，三点土样混合为1份， 4 ℃低温保存。
1.2药品与试剂
甘油、氢氧化钠、无水乙醇、蔗糖、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、氯化钠、可溶性淀粉、硫酸镁、蛋白胨、硫酸铵、硫酸：上述药品均为分析纯，购于河南万邦化工有限公司；琼脂、酵母粉、琼脂糖、结晶紫（分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖(分析纯)：江苏华裕试验有限公司；氯化铁（分析纯）：上海展云化工有限公司；碳酸钙（分析纯）：沈阳市新化试剂厂；黄豆枯粉（食品级）：市场购入；硝酸钠（分析纯）：天津市博迪化工有限公司；钼酸铵（分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；草酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；抗坏血酸（分析纯）：天津市恒兴试剂厂。
1.3仪器
BS-124S型分析天平：赛多斯仪器有限公司；PHS-300型pH计：上海天达仪器有限公司；HZP-150型全温振荡培养箱：上海精宏试验设备有限公司；DRP-9272型电热恒温培养箱：上海森信试验仪器有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；CT18RT型速冷冻离心机：上海驭诺试业公司；T200Y型电子天平：昆山天金岗金属制品有限公司；202-2型电热恒温干燥箱：上海阳光试验仪器有限公司；721E型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；SW-CJ-2FD型洁净工作台：上海万锐试验设备有限公司；MOTIC BA220型显微镜：北京麦克奥迪仪器仪表公司。
1.4培养基[12]
分离筛选培养基、种子液培养基及发酵培养基。
1.5解硅细菌的分离及初筛[13]
采用稀释涂布平板法，将10-3、10-4、10-5三个浓度梯度的土壤稀释液涂布到初筛培养基上，37 ℃培养4~7 d，挑取初筛平板上生长较好，透明、粘稠、易挑起的菌落在平板上划线纯化，并于4℃保藏。
1.6解硅细菌的复筛[14]
挑取纯化菌株接种于种子液培养基，150 r/min、37℃条件下恒温振荡24h，制成种子液，将种子液按5%接种量接种到50 mL/250 mL发酵培养基，37 ℃、150 r/min ,培养5 d。以加等量灭活种子液为对照，每个处理设3个重复。
1.7浸出液硅含量的测定方法
硅钼蓝比色法[15]。
1.8 HDB02菌株鉴定
1.8.1形态学鉴定[16]
将所筛选菌株接种于分离筛选培养基，培养并记录菌落形态特征。挑取单菌落制作菌悬液，进行革兰氏染色，光学显微镜下观察。
1.8.2生理生化鉴定[17]
接触酶试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、产H2S试验和甲基红试验。
1.8.3 HDB02菌株分子生物学鉴定
(1)HDB02菌株基因组DNA提取[18]
(2)HDB02菌株16S rDNA扩增
PCR产物由北京六合华大基因科技有限公司进行DNA测序。测序结果在美国国家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）网站作基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行序列比对。
1.9菌株HDB02发酵条件优化
1.9.1HDB02菌株解硅效果影响因素研究
(1)碳源对HDB02菌株解硅效果的影响
分别以葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇、蔗糖为碳源，其它成分同发酵培养基，初始pH为7.2～7.4，在150 r/min，37 ℃条件下恒温振荡培养5 d，测定浸出液中硅的含量。每组试验设三个平行，取试验结果的平均数值。
(2)氮源对HDB02菌株解硅效果的影响
以上述试验中最优结果为碳源，分别以硫酸铵、蛋白胨、黄豆枯粉、硝酸钠为培养基中的氮源，其它成分同发酵培养基，测定浸出液硅含量。
(3)初始pH对HDB02菌株解硅效果的影响
以上述试验中最优结果为碳源和氮源，其它成分同发酵培养基，分别以5.0、6.0、7.0、8.0为培养基的初始pH值，测定浸出液硅含量。
(4)发酵时间对HDB02菌株解硅效果的影响
确定最佳碳源、氮源和初始pH的条件下，其它成分同发酵培养基。分别以0 d、1 d、2 d、3 d、、5 d、8d为培养基发酵时间，测定浸出液硅含量。
(5)温度对HDB02菌株解硅效果的影响
确定最佳碳源、氮源、初始pH和发酵时间的条件下，其它成分同发酵培养基。分别以22 ℃、27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃为培养基发酵温度，测定浸出液硅含量。
1.9.2 HDB02菌株对铁尾矿解硅效果培养条件优化
采用Box-Behnken响应面分析法，以蔗糖添加量(A)、硝酸钠添加量(B)、pH(C)三个因素为自变量，以浸出液硅含量为响应值，设计三因素三水平响应面试验(见表1)。
表1 响应面因素水平表
Tab.1 Response surface factor level table
水平 | 因素 |
A.蔗糖（g/L） | B.硝酸钠（g/L） | C.pH |
-1 | 5 | 0.5 | 7.5 |
0 | 10 | 1 | 8.0 |
1 | 15 | 1.5 | 8.5 |
1.10数据统计与分析
通过MEGA 7.0绘制系统发育树；Origin 9.0专业函数绘图软件绘制单因素试验结果图；Design-Expert version 8.0.6软件对数据进行回归分析；SPSS 17.0软件对试验数据进行方差分析。
2结果与分析
2.1脱硅菌的分离筛选及形态特征
通过梯度稀释涂布法和平板划线分离法，共分离出了24株解硅细菌，筛选出一株高效解硅菌株HDB02。该菌株在亚历山大罗夫培养基上生长4d后可见大量菌落，菌落透明，呈圆形，边缘整齐，易挑取，菌落大小约为3~4 mm，菌落平板形态如图1（a）所示，HDB02在光学显微镜1000倍下呈杆状，大小约为2~3um，如图1（b）所示。
图1 HDB02菌落平板形态（a）及光学显微镜图（1000×）（b）
Fig.1 Colony plate morphology (a) and light micrograph (1000×) (b) of HDB02 strain
2.2 HDB02菌株鉴定
2.2.1生理生化特征
对HDB02菌株进行生理生化鉴定，结果如表2所示，结果表明HDB02菌株为细菌。
表2 HDB02菌株的生理生化特征
Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of HDB02 strain
生理生化鉴定 | 结果 |
革兰氏染色 | - |
接触酶 | + |
明胶化 | + |
淀粉水解 | + |
甲基红 | - |
产H2S | - |
注：“-”表示阴性，“+”表示阳性
2.2.2构建HDB02菌株系统发育树
根据BLAST结果，选取与HDB02菌株序列相近的13组菌株的序列，如表3，运用MEGA 7.0软件建立Neighbor-Joining系统发育树，结果如图2，EU373312 Agrobacterium_larrymoorei strain SSR03处于同一分枝，相似度99.89%，与BLAST结果吻合。
表3 HDB02菌株16S r DNA序列BLAST的结果
Tab.3 Results of BLAST of 16S r DNA sequences of HDB02 strain
序号 | 菌株 | 相似度 | 登录号 |
1 | Agrobacterium larrymoorei strain SSR03 | 99.89 | EU373312 |
2 | Agrobacterium larrymoorei_strain AF3.10 | 99.85 | NR026519 |
3 | Agrobacterium vitis strain K309 | 95.41 | NR036780 |
4 | Agrobacterium rhizogenes strain IFO 13257 | 94.21 | NR043398 |
5 | Agrobacterium rhizogenes strain ATCC 11325 | 94.23 | NR104207 |
6 | Agrobacterium rhizogenes strain NBRC 13257 | 94.21 | NR113607 |
7 | Agrobacterium vitis strain NBRC 15140 | 95.39 | NR113735 |
8 | Agrobacterium rubi strain IFO 13261 | 97.77 | NR115518 |
9 | _Agrobacterium rubi_strain LMG 156 | 97.62 | NR115518 |
10 | Agrobacterium tumefaciens strain IAM 12048 | 98.21 | NR041396 |
11 | Agrobacterium tumefaciens strain NCPPB2437 | 98.15 | NR115516 |
12 | Agrobacterium tumefaciens strain UQM 1685 | 98.59 | NR116306 |
13 | Sinorhizobium meliloti strain IAM 12611 | 94.60 | NR043399 |
图2 HDB02菌株的Neighbor-Joining系统发育树
Fig.2 Neighbor-Joining phylogenetic tree of the HDB02 strain
2.3 菌株HDB02发酵条件优化
2.3.1HDB02菌株解硅效果影响因素研究结果
(1)碳源对HDB02菌株解硅效果影响
试验结果如图3所示，不同碳源对铁尾矿浸出液硅含量影响由高到低依次为葡萄糖、蔗糖>甘露醇>可溶性淀粉，其中葡萄糖和蔗糖对浸出液硅含量的影响显著高于甘露醇和可溶性淀粉（P<0.01），但蔗糖与葡萄糖试验结果没有显著性差异（P>0.05），从经济角度考虑选择蔗糖作为后续试验碳源。
图3 不同碳源对铁尾矿浸出液硅含量影响
Fig.3 Effects of different carbon sources on silicon content in leaching solution of iron tailings、
(2)氮源对HDB02菌株解硅效果影响
试验结果如图4所示，不同氮源对铁尾矿浸出液硅含量影响由高到低依次为硝酸钠＞硫酸铵＞蛋白胨＞黄豆枯粉，其中硝酸钠作为氮源时，浸出液中硅含量显著高于其他氮源（P<0.01），故选择硝酸钠为后续试验氮源。
图4 不同氮源对铁尾矿浸出液硅含量影响
Fig.4 Effects of different nitrogen sources on silicon content in leaching solution of iron tailings
(3)温度对HDB02菌株解硅效果影响
试验结果如图5所示，各培养温度下浸出液硅含量由高到低依次为：32 ℃＞37 ℃＞27 ℃＞42 ℃＞22 ℃，其中培养温度为32 ℃时，浸出液硅含量显著高于其他温度（P<0.01），故选择32 ℃为后续试验培养温度。
图5 不同温度对铁尾矿浸出液硅含量影响
Fig.5 Effects of different temperatures on silicon content in leaching solution of iron tailings
(4)初始pH对HDB02菌株解硅效果影响
试验结果如图6所示，不同起始pH浸出液硅含量由高到低依次为： 8.0＞7.0＞5.0＞6.0，其中培养基起始pH调节至8.0时，浸出液硅含量显著高于其他条件所得结果（P<0.01），故选择pH 8.0为后续试验起始pH。
图6 不同pH对铁尾矿浸出液中硅的含量影响
Fig.6 Effects of different pH on silicon content in leaching solution of iron tailings
(5)浸矿时间对HDB02菌株解硅效果影响
试验结果如图7所示，不同培养时间下浸出液硅含量由高到低依次为：8 d＞5 d＞3 d＞2 d＞1 d＞0 d，其中培养时间为5 d和8 d时，浸出液硅含量无显著差异（P>0.05），故选择5 d为后续试验培养周期。
图7 浸矿时间对铁尾矿浸出液中硅的含量影响
Fig.7 Effects of different time on silicon content in leaching solution of iron tailings
2.4.3.2 HDB02菌株发酵条件优化结果
(1)响应面分析与试验结果
HDB02菌株发酵条件的拟合二阶响应面3因素3水平L17中心组合试验及结果，见表4。
表4 响应面试验设计和试验结果
Tab.4 Response surface experimental design and experimental results
序号 | 因素 |
A蔗糖（mg/L） | B硝酸钾（mg/L） | pH | 浸出液硅含量（mg/L） |
1 | -1.000 | -1.000 | 0.000 | 101.294 |
2 | 1.000 | -1.000 | 0.000 | 116.661 |
3 | -1.000 | 1.000 | 0.000 | 116.179 |
4 | 1.000 | 1.000 | 0.000 | 111.089 |
5 | 0.000 | 0.000 | -1.000 | 109.399 |
6 | -1.000 | 0.000 | -1.000 | 120.451 |
7 | 1.000 | 0.000 | 1.000 | 109.706 |
8 | 1.000 | 0.000 | 1.000 | 110.121 |
9 | -1.000 | -1.000 | -1.000 | 117.613 |
10 | 0.000 | 1.000 | -1.000 | 121.707 |
11 | 0.000 | -1.000 | 1.000 | 110.430 |
12 | 0.000 | 1.000 | 1.000 | 121.662 |
13 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 124.436 |
14 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 123.563 |
15 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 122.398 |
16 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 120.452 |
17 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 122.115 |
(2)发酵条件优化响应面方差分析
发酵条件响应面优化结果见表5，对试验数据进行二元回归拟合，并得出回归方程：
浸出液硅含量(mg/L)=122.59+2.72A+3.08B-2.16-5.11AB-2.66AC+1.78BC-8.36A2-2.93B2-1.81C2
方差分析结果见表5，模型的P＜0.01极显著，失拟项的P>0.05不显著；模型回归方程的系数显著性检验如下：一次项A（蔗糖）、B硝酸钠C（pH）极显著；二次项A2、B2达到极显著水平。
表5 回归模型方差分析表
Tab.5 Regression model ANOVA table
来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 |
模型 | 685.21 | 9 | 76.13 | 35.86 | < 0.0001 |
A-蔗糖 | 59.10 | 1 | 59.10 | 27.84 | 0.0012 |
B-硝酸钠 | 75.89 | 1 | 75.89 | 35.74 | 0.0006 |
C--pH | 37.20 | 1 | 37.20 | 17.52 | 0.0041 |
AB | 104.62 | 1 | 104.62 | 49.28 | 0.0002 |
AC | 28.29 | 1 | 28.29 | 13.32 | 0.0082 |
BC | 12.74 | 1 | 12.74 | 6.00 | 0.0441 |
A2 | 294.30 | 1 | 294.30 | 138.62 | < 0.0001 |
B2 | 36.06 | 1 | 36.06 | 16.99 | 0.0045 |
C2 | 13.84 | 1 | 13.84 | 6.52 | 0.0379 |
残差 | 14.86 | 7 | 2.12 |
|
|
失拟项 | 5.67 | 3 | 1.89 | 0.82 | 0.5454 |
纯误差 | 9.19 | 4 | 2.30 |
|
|
总和 | 700.07 | 16 |
|
|
|
注：P＞0.05 表明模型影响不显著；P＜0.05 表明模型具有显著影响；P＜0.01 表明模型影响极显著。
(3)响应面交互作用分析与优化
通过Box-Behnken中心组合设计法得到的响应面曲线图及底部等高线图（图8、9、10、11、12、13），，进行可视化的分析确定最优点，用于进一步研究。
图 8 Y=F(蔗糖，硝酸钠)响应曲面图与等高线图
Fig.8 Y=F (sucrose, potassium nitrate) response surface plot and contour plot
图 9 Y=F(蔗糖，pH)响应曲面图与等高线图
Fig.9 Y=F(sucrose, pH) response surface plot and contour plot
图 10 Y=F(硝酸钠，pH)响应曲面图与等高线图
Fig.10 Y=F(potassium nitrate, pH) response surface plot and contour plot
从图8、9、10中可以看出，培养基中硝酸钠含量对溶液中硅含量影响较明显，各因素影响强弱顺序为硝酸钠>蔗糖> pH。经优化后最佳发酵条件为：蔗糖11.3 g/L，硝酸钠1.03 g/L，pH 7.62，溶液中硅含量预测值为123.865 mg/L。
为了检验模型的准确性，在最优条件下进行验证试验，结果浸出液硅含量平均值为126.03 mg/L，试验结果符合预期值。由此可以看出预测模型可以很好预测HDB02菌株解硅发酵效果。
3结论
本试验从土壤样品中分离筛选得到一株高效解硅菌株HDB02，结合菌落形态特征、生理生化特性及16SrDNA序列分析，初步鉴定为土壤杆菌属(Agrobacterium sp.);通过单因素试验与响应面试验对HDB02的发酵件优化，结果表明HDB02的最佳发酵条件为: 蔗糖11.3g/L，硝酸钠1.03 g/L，初始pH 7.62，培养温度为32 ℃，培养周期为5 d。
参考文献
[1]罗红艺,景红娟.植物营养中新的必需元素——钠、镍、硅[J].高等函授学报(自然科学版),2002,(03):42-45.
[2]苏素苗,杨春雷,饶雄飞,等.硅对植物抗逆性影响的研究进展[J].华中农业大学学报,2022,41(06):160-168.
[3]易晓璇,马肖,刘木兰,等.硅对植物逆境胁迫耐受能力的影响及其机理研究进展[J].作物研究,2020,34(04):398-404.
[4]王丹.硅提高烟草幼苗抗盐性的效果及作用机理[D].山东农业大学,2022,6.
[5]张雅珍,王琳,邓彩萍,等.硅对植物抗旱性影响的研究进展[J].湖北农业科学,2016,55(10):2449-2453.
[6]黄阔,张永强,李国慧.化学元素硅、硒对作物健康生长作用的研究进展[J].植物医生,2019,32(05):16-19.
[7]黄麟凯,聂馥玲.《化学鉴原》翻译中的结构调整与内容增删[J].自然科学史研究,2020,39(03):321-335.
[8]刘杰,罗尊长,肖小平,等.土壤调理剂对冷浸田土壤特性及水稻生长的影响[J].土壤2016,48(3):529-533.
[9]卢召艳,魏晓,李红,等.环洞庭湖区稻田土壤中硅分布特征及其影响因素[J].水土保持通报,2017,37(04):27-32.
[10]史秀宏. 硅酸盐菌剂对土壤有效养分含量及水稻产量的影响[D].东北农业大学,2016.
[11] 曹建芳.硅酸盐矿物分解细菌的定向筛选及其活化土壤硅的研究[D].南京农业大学,2010,6.
[12] 张成凯,蒙悦,殷志秋,等.高效解硅菌的分离鉴定及其促生能力[J].微生物学通报,2022,49(11):4740-4751.
[13] ZHANG A M, ZHAO C Y, GAO T G, et al. Solubilization of insoluble potassium and phosphate by Paenibacillus kribensis CX-7: A soil microorganism with biological control potential[J]. Afr J Microbiol Res, 2013, 7(1):41-47.
[14] 罗娜,周德明,徐睿,等.降香黄檀、檀香根际解钾菌的筛选与活性研究[J].热带作物学报,2016,37(5):964-970.
[15] GB/T 5686.2-2022, 锰铁、锰硅合金、氮化锰铁和金属锰硅含量的测定 钼蓝分光光度法、氟硅酸钾滴定法和高氯酸重量法[S].北京:中国标准出版社,2022.
[16] BHATTACHARYA S, BACHANI P, JAIN D, et al. Extraction of potassium from K-feldspar through potassium solubilization in the halophilic Acinetobacter soil (MTCC 5918) isolated from the experimental salt farm[J].Int J Min Process, 2016,152:53-57.
[17] VASSILEV N,EICHLER L B,VASSIEVA M.Stress-tolerant P-solubilizing microorganisms[J]. Appl Microbiol Biotechn, 2012, 95(4):851.
[18] 云飞,梁林,鲍彦彬,石雅丽,等.革兰氏阳性与阴性细菌基因组DNA提取方法的优化[J].安徽农业科学,2021,49(10):98-100.
